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一种牙髓干细胞培养方法

所属:牙髓干细胞   来源:未知   作者:admin   点击:176次   时间:2020-10-30 15:00


文章导读:本发明涉及干细胞领域,具体涉及一种牙髓干细胞的培养方法,尤其是涉及一种乳牙牙髓干细胞的培养方法。... ...

一种乳牙牙髓干细胞的培养方法

【技术领域】

本发明涉及干细胞领域,具体涉及一种牙髓干细胞的培养方法,尤其是涉及一种乳牙牙髓干细胞的培养方法。

 

 


【背景技术】
2003年,米乌拉等人在乳牙的牙髓组织中发现了一种多能干细胞。与骨髓间充质干细胞和恒牙髓干细胞相比,它具有更高的增殖率、细胞群增殖能力、克隆形成能力和高分化能力,被命名为牙髓干细胞。人原代牙髓干细胞是间充质干细胞的一种,具有自我复制和多向分化的能力,可诱导分化为牙本质、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞、肌肉细胞等。人类有20颗乳牙,在乳牙和恒牙交替的过程中会逐渐自然脱落。因此,牙髓组织的来源非常容易且无创。牙髓组织来源于自体组织,无免疫排斥反应,安全性高。鉴于上述生物学特性,牙髓干细胞在骨和牙组织再生修复、神经系统疾病和肌肉萎缩、免疫系统疾病、皮肤创伤、肝脏疾病等治疗中具有广阔的应用前景。申请号为201210514497的中国专利。x公开了一种牙髓干细胞的大规模生产工艺。如下所述:在步骤(一)中,在无菌条件下选择牙髓组织,用缓冲液洗涤并切成块;用体积为5-10倍的0.1%-0.6%的胶原酶消化牙髓组织,在37℃的培养箱中培养30-180分钟,然后用含有胎牛血清的细胞培养液终止消化,所述细胞培养液选自含有10-20%胎牛血清的市售D-MEM、DMEM培养基和无血清培养基。但这种方法酶解时间过长,组织被过度消化,获得的牙髓干细胞数量少。此外,该方法采用含胎牛血清的DMEM培养物,污染来源,批次间稳定性差,不利于在动物模型中使用细胞。

【发明内容】

有鉴于此,本发明的目的是针对现有技术中存在的问题,提供一种培养乳牙髓干细胞的方法。通过本发明的方法培养的细胞形态良好,呈梭形和簇状生长趋势,细胞活性高,简单经济,可获得大量高纯度的乳牙髓干细胞,并能保持乳牙髓干细胞良好的干细胞特性。

为了达到本发明的目的,本发明采用如下技术方案:

一种乳牙牙髓干细胞的培养方法,包括以下步骤:切取牙髓组织,加入ⅰ型胶原酶,在37℃和200转/分的温度下消化10-20分钟,停止用无血清培养基消化,吹去离散细胞团块,得到单个离散细胞,加入细胞悬液使细胞重悬,调节细胞密度,在37℃和95%湿度的二氧化碳培养箱中培养,当细胞生长到80%时,细胞悬液由无血清培养基、表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子组成。本发明乳牙牙髓干细胞的培养方法,采用ⅰ型胶原酶在37℃下酶解消化牙髓组织10-20min,可获得更多细胞。同时,本发明的培养方法全程采用无血清培养和传代,避免采用胎牛血清DMEM培养基培养。

在一些实施方案中,本发明培养方法中ⅰ型胶原酶的添加量是牙髓组织体积的10-20倍。

在一些优选的实施方案中,本发明培养方法中ⅰ型胶原酶的浓度为0.3%?0.5%ο是3g/L?5g/L.

本发明的培养乳牙牙髓干细胞的方法,乳牙可以取自经家人认可的儿童因滞留拔除的无牙髓疾病和坏死的乳门牙,拔除后立即放入含双抗体的4℃PBS离心管中,24小时内取出使用。含双抗体的PBS为含青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液,其中青霉素的工作浓度为100单位/毫升,链霉素的工作浓度为0.lmg/mL.

本发明的乳牙牙髓干细胞的培养方法,预先用含有双抗体的PBS溶液反复冲洗牙齿三次,用无菌纱布包裹牙齿,用钳子撕开,露出牙髓组织;用无菌镊子夹住牙髓组织,切除顶端Imm的牙髓组织。

本发明的培养乳牙牙髓干细胞的方法,根据牙髓组织的大小,通过眼科弯曲剪将牙髓组织切割成Im3。

在一些实施方案中,培养方法进一步包括洗涤单个离散细胞的步骤。

在一些优选的实施方案中,培养方法的洗涤具体包括离心后用PBS洗涤沉淀物,并通过离心收集沉淀物。在一些具体实施例中,离心是1000转/分-2000转/分,持续3-5分钟。

在一些实施方案中,培养方法的单个离散细胞的直径小于70。m.在一些实施例中,获得单个离散细胞的方法是吹散离散细胞团并通过70°过滤器过滤它们。手机屏幕。

在一些实施方案中,培养方法的细胞密度为2×103/cm2至5×103/cm2。接种细胞密度为2×103/cm2-5×103/cm2时,Pl代的细胞数比原代细胞可扩增20倍。

在一些实施方案中,培养方法的细胞悬浮液中表皮生长因子的最终浓度为10微克/毫升。

在一些实施方案中,培养方法的细胞悬浮液中碱性成纤维细胞生长因子的最终浓度为10微克/毫升。

在一些实施方案中,在培养方法的培养过程中,细胞悬浮液每三天更换一次。

在一些实施方案中,培养方法中胰蛋白酶的浓度为0.125%。

在一个具体的例子中,取通过申请201210514497中公开的方法培养的细胞。作为对比实施例,观察到通过实施例1的方法培养7天的细胞具有高细胞活性,并且细胞活性达到90%以上;细胞增殖快,收获的细胞数量多,一次分离7-8天即可生长到80-90%;只需一次传代,细胞数可在3-5天内扩增20倍以上。

在一个具体实施方案中,观察细胞表面标记的表达。结果表明,用本发明的方法培养的乳牙髓干细胞的第1代、第6代和第10代细胞表面标记无明显变化。乳牙牙髓干细胞表面标记CD45(白细胞阳性)和HLA-DR(MHC-1I分子)均为阴性,而间充质干细胞表面标记CD59和CD90同时均为阳性。第三代以后,乳牙牙髓干细胞细胞形态均匀,纯度达到98%以上。

在一个具体的例子中,观察到由P3代细胞诱导的成脂分化。结果表明,用本发明的培养乳牙髓干细胞的方法培养的乳牙髓干细胞,诱导后进行油红O染色,可见明显的脂滴形成。

在一个具体的例子中,观察到由P3代细胞诱导的成骨分化。结果表明,与对照组相比,用本发明方法培养的乳牙髓干细胞有明显的钙结节。表明成骨细胞的形成。

乳牙牙髓干细胞的培养方法,包括以下步骤:取牙髓组织,切割,加入ⅰ型胶原酶,在370℃和200转/分的条件下消化10-20分钟,停止用无血清培养基消化,吹出离散细胞团,得到单个离散细胞,加入细胞悬液使细胞重悬,调节细胞密度,在37℃和95%湿度的二氧化碳培养箱中培养;当细胞生长到80%时,细胞悬液由无血清培养基、表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子组成。本发明培养方法操作简单,安全有效。实验表明,与现有方法相比,本发明所培养的乳牙髓干细胞的细胞形态良好,呈梭形和簇状生长趋势;细胞活性高,经细胞计数器鉴定细胞活性达到90%以上;细胞增殖快,收获的细胞数量多,初分离7-8天即可生长到80-90%;细胞数仅经过一次传代即可在3-5天内扩增20倍以上;和良好干细胞特性,适用于乳牙牙髓干细胞的大量培养。



一种牙髓干细胞培养方法

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