撰文：吴周睿，李琛，祝然，程黎明
脊髓损伤是一种椎管内神经组织的急性创伤性损伤，可产生多种神经问题，如感觉和运动反应功能障碍。然而，脊髓损伤后原发性和继发性损伤的主要分子功能过程仍不清楚。既往对脊髓损伤的转录组研究结果表明，基因表达模式随着时间的推移而变化[1]。除转录分析外，表观遗传分析，如微小RNA高通量测序也逐渐引起重视[2]。然而，只有少数研究探索了脊髓损伤后DNA甲基化状态的变化[3-5]。近年来，对脑发育过程中DNA甲基化模式的深入研究表明，DNA甲基化存在于特定的基因组区域，尤其是与染色质开放获取相关的区域，因此对转录启动至关重要，可导致发育过程中转录组的改变。DNA甲基化调控已被证明与多种脊髓损伤相关的功能反应密切相关。如DNA甲基化与神经元死亡有关[6]，并能调控神经元轴突再生和生长锥发育[7]，还可参与神经胶质细胞分化和命运的决定[8]，以及促进炎症反应和激活[9]和血管生成[10]。因此，脊髓损伤后DNA甲基化状态的改变必须被认为是一个重要的调控因素。此外，解析脊髓损伤后功能反应的时序性也需要深入了解DNA甲基化改变的时间规律。
最近，中国同济大学附属同济医院程黎明团队在《中国神经再生研究（英文版）》（Neural Regeneration Research）上发表了题为“Reduced non-CpG methylation is a potential epigenetic target after spinal cord injury”的研究，发现脊髓损伤后DNA甲基化的整体降低，尤其是非CpG类。此外，DNA甲基化鉴定的脊髓损伤后功能时间窗结果与既往RNA测序的结果一致，强调了其在脊髓损伤中的重要作用。DNA甲基化与多梳家族(Polycomb group，PcG)共同参与转录调控，并主要靶向与再生相关的过程，如轴突发生和组织发育与再生。这一研究揭示，非CPG甲基化降低是小鼠脊髓损伤后重要的表观遗传靶点，可通过调控脊髓损伤后再生事件发挥重要的转录调控作用。
程黎明等建立了小鼠T9脊髓损伤的简化基因组甲基化测序（RRBS）库，并得出重要的发现（图1）。首先，脊髓损伤后DNA甲基化水平降低，大部分下降在非CpG甲基化区域。然后，利用层次聚类和主成分分析，确定甲基化相关疾病的时间窗口，发现第0-3天代表早期，第7-14天代表中期，第28-42天代表晚期。此外，甲基化损失在中期最为显著，而早期和晚期的低甲基化水平相似。对不同基因组区域的分析表明，DNA甲基化主要集中在基因间区域。正如预期的那样，转录起始位点的CpG甲基化缺失。此外，内含子中CHG和CHH甲基化水平明显高于其他区域。脊髓损伤后基线CpG和CHH甲基化水平增加，而CHG甲基化水平没有模型变化。与假手术组相比，脊髓损伤组中多个基因区域中CpG甲基化水平几乎没有改变。相比之下，启动子区、5非翻译区、外显子、内含子和3非翻译区中的CHG和CHH甲基化水平均显著下降。
图1甲基化胞嘧啶在小鼠脊髓损伤后CG和非CG环境中是动态且丰富的（图源：Wu et al., Neural Regen Res, 2023）
另外，研究还关注于基因启动子区域中DNA甲基化的改变，鉴定出由于脊髓损伤而导致的高甲基化或低甲基化的基因，并对进行聚类和功能注释。DNA甲基化标记是中枢神经系统中的主要表观遗传调节因子，程黎明等揭示了脊髓损伤后每个阶段的特点（图2）。CpG甲基化显示出明确的阶段特异性聚类。基于CpG和非CpG甲基化之间的簇差异，使用分层聚类方法可将脊髓损伤分为3组。第1组包含第0，1和3天，第2组包括第7和14 天，第3组包括第28和42天，这3组分别代表了脊髓损伤的早中晚期。此外，每个组之间的距离显示了明确的时间特性。接下来根据3个损伤阶段重新评估DNA甲基化水平，发现非CpG甲基化是甲基化下降的主力。
图2 CpG甲基化模式决定了脊髓损伤后的功能分期（图源：Wu et al., Neural Regen Res, 2023）
紧接着，研究使用SeqMonk及其注释数据库来研究差异甲基化区在不同基因组元件中的行为，以全面了解其的变化（图3）。结果发现，非CpG，而不是CpG的差异甲基化区发生了显著的改变，与既往研究一致，非CpG区的绝对甲基化水平远低于CpG区。CpG和非CpG的差异甲基化区在脊髓损伤后早期和中期呈现出低甲基化状态。第14天后，甲基化水平逐渐恢复，但与假手术组仍有相当程度差距。为阐明每个时间点DNA甲基化的功能过程，对不同时间点对启动子差异甲基化区簇进行了基因本体（GO）分析，结果发现CpG甲基化主要参与早期和晚期的神经发生相关调节机制。
图3脊髓损伤后不同时间时CpG、CHG和CHH背景下差异甲基化区的变化（图源：Wu et al., Neural Regen Res, 2023）
既往研究认为，基因DNA甲基化对哺乳动物中枢神经系统的发育、成熟和疾病发病具有深远影响，其与转录直接相关[11]。为更好地了解脊髓损伤后DNA甲基化和基因表达调控的机制，程黎明等对损伤后脊髓环境和区域的DNA甲基化和基因表达水平进行了Pearson相关分析（图4）（使用的基因表达数据是从既往研究中收集的[1]）。关于CpG甲基化，启动子和内含子甲基化水平与基因表达水平呈负相关，但外显子CpG甲基化水平与基因转录水平无关。而CHG和CHH甲基化水平与启动子、外显子和内含子中的基因转录水平均呈负相关。此外，启动子中DNA甲基化与不同时间间隔的基因转录之间存在负相关。CpG和CH簇1和2以中等水平表达，其甲基化水平大于其他簇。簇5和6表现出相反的模式，具有更高的基因表达水平，但较低的DNA甲基化水平。尽管脊髓损伤后15 min内（第0天）基因转录的累积改变不明显，但与假手术组相比，DNA甲基化，特别是CHG和CHH甲基化均发生了显著的变化。检查脊髓损伤的早期和中期阶段，可发现转录上调基因中的DNA甲基化水平均出现下降。
图4 脊髓损伤中DNA甲基化与基因转录的相关性（图源：Wu et al., Neural Regen Res, 2023）
综上，从脊髓损伤的早期到晚期，DNA甲基化与神经元/轴突再生、突触形成、离子通道、囊泡转运、微管形成和神经回路投射构建有关。多个神经发育信号通路，包括WNT、转化生长因子和胰岛素样生长因子通路，都依赖于DNA甲基化。DNA甲基化对于通过蛋白质修饰系统介导的下游过程也至关重要，如磷酸化、泛素化、糖基化和其他修饰，以及Ras、MAPK、PI3K-AKT和Hippo通路，表明其在蛋白质成熟、激活、失活和降解中均起着至关重要的作用。DNA甲基化标记可与其他表观遗传改变标记相互作用，主要是组蛋白修饰标记，表明脊髓损伤后DNA甲基化对基因转录的控制涉及与其他表观遗传过程的协同作用。DNA甲基化参与调控转录复合物相关过程，特别是那些涉及PcG家族转录因子的过程，对基因转录至关重要。因此这一研究详细描述了DNA甲基化所起的作用以及脊髓损伤过程中这种修饰的动态特征。
然而，仍存在一些问题无法通过RRBS技术来回答，RRBS是基于甲基化敏感的限制性内切酶（Msp1），其富集了基因组周围CCGG含量的胞嘧啶甲基化，但含有CpG识别位点的数量太少，基因组覆盖率低。另外其不能用于区分由TET蛋白家族成员介导的甲基化胞嘧啶（5mC）和羟甲基化胞嘧啶（5hmC）。全基因组甲基化测序（WGBS）为研究CpG岛以外的感兴趣区域提供了思路，氧化亚硫酸氢盐测序（oxBS-Seq）揭示5hmC修饰模式也将是个有趣的研究方向。此外，单细胞RRBS或带流式细胞术的RRBS可进一步研究DNA甲基化如何调节不同细胞类型中的基因转录的详细信息。
原文链接：https://doi.org/10.4103/1673-5374.371399
参考文献
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通讯作者：程黎明，主任医师，教授，博士生导师。同济大学附属同济医院骨科学科带头人，脊柱脊髓损伤再生修复教育部重点实验室主任、上海市重中之重重点学科骨外科带头人、上海市重点专科脊柱外科带头人、国家万人计划科技创新领军人才、国家重点研发计划首席科学家、国家百千万人才工程人选、国家有突出贡献中青年专家、国家特殊津贴获得者、上海领军人才、上海市科技精英、上海医学发展杰出贡献奖获得者、上海市先进工作者。同时担任世界神经修复学会（IANR）理事、中国研究型医院神经转化研究专委会副主任委员、上海市医师协会骨科医师分会副会长等。
程黎明教授临床主攻脊柱脊髓损伤的再生修复、脊柱退变性疾病的微创化治疗以及脊柱外科疑难杂症的诊治与康复，并率先提出了“早期损伤控制、全过程康复”的脊髓损伤救治策略，组建了“外科-康复-生物一体化”团队，主持国家重点研发计划、国家自然科学基金重点项目等20余项。发表论文百余篇，其中Cell、Nature Medicine、Advanced Materials等SCI、EI收录论文60余篇；中华核心期刊30余篇。主编著作3部；获批专利17项，其中发明专利11项；获中国康复医学会科学技术奖一等奖、上海市康复医学会科学技术奖一等奖、华夏医学科技奖一等奖、上海市科技进步奖一等奖、上海市科技进步奖推广奖等省部级奖励10余项。
文章摘要：DNA甲基化是疾病发生发展的重要表观遗传调节因子；DNA甲基化调控已被证明与多种脊髓损伤相关的功能反应密切相关。为了解DNA甲基化在脊髓损伤中的作用，实验构建了小鼠脊髓损伤后0-42d的连续简并代表性亚硫酸氢盐序列文库（RRBS）。发现脊髓损伤后， DNA甲基化水平整体降低，尤其是非CpG类。基于整体DNA甲基化模式的相似性和层次聚类，使用分层聚类方法可将脊髓损伤分为3个阶段，第0-3天、第7-14 天、第28-42天，分别代表了脊髓损伤的早中晚期。非CpG甲基化尽管占总甲基化丰度的比例很小，但其水平，包括CHG和CHH甲基化水平，显著降低。启动子区、5非翻译区、外显子、内含子和3非翻译区中的非CpG甲基化水平均显著下降，而CpG甲基化水平几乎没有改变。约一半的差异甲基化区位于基因间区，CpG和非CpG区的其他差异甲基化主要聚集在内含子区中，且其中DNA甲基化水平最高。接下来分析了启动子区与差异甲基化区相关基因的功能。根据基因本体分析的结果，DNA甲基化与脊髓损伤的多项基本功能反应有关，包括神经元突触连接建立和轴突再生。令人惊讶的是，CpG甲基化和非CpG甲基化均与胶质细胞或炎性细胞功能反应无关。综上，此次实验得到了脊髓损伤后DNA甲基化的动态模式，并发现非CPG甲基化降低是小鼠脊髓损伤后重要的表观遗传靶点。
文章关键词：脊髓损伤；DNA甲基化；动态特征；基因本体分析；CpG甲基化；非CpG甲基化；差异甲基化区；胞嘧啶部分；单细胞RNA测序；DNA甲基转移酶
文章来源：Wu Z, Li C, Zhu R, Cao Y, Chen TC, Cheng L (2023) Reduced non-CpG methylation is a potential epigenetic target after spinal cord injury. Neural Regen Res 18(11):2489-2496.
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