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乳牙牙髓干细胞分离方法

29 次浏览 编辑 基因细胞服务中心
2020-10-30 06:27:08

口腔干细胞(oralstemcells)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞,被认为是起源于神经嵴的间充质干细胞。乳牙牙髓干细胞(shed)是口腔干细胞的一种,其高表达stro-1,cd146,oct4,cd29,cd31,cd44等细胞标志物,但不表达或低表达cd14,cd34,cd43,cd45在适当条件下可分化为骨细胞、软骨细胞、肝细胞、神经样细胞等。与骨髓间充质干细胞(bmmsc)相比,shed更易分离得到,并且增殖更快,具有比bmmsc更强的细胞克隆形成能力。

神经细胞是各种神经性疾病研究和治疗的基础,然而神经细胞较难分离获得,且难以在体外大规模扩增。使用shed能实现细胞数量的快速扩增,通过神经定向分化诱导即可获得大规模的神经细胞。当进行神经定向分化诱导时,shed表达神经胶质和神经元细胞表面标志物,如巢蛋白(nestin)。

现有技术分离乳牙牙髓干细胞,一般使用电钻打磨牙冠暴露牙髓腔,提取牙髓组织后使用单一的胶原酶进行消化,这种分离方法较为复杂,并且高活性细胞获得率较低;在shed的神经定向分化过程中,现有技术通常为一步法,在培养初期加入各种诱导因子,整个诱导期间培养基成分不变,诱导周期较长且转化率较低。

需要对shed的培养和神经定向分化都进行改进,以提高分离培养和诱导分化的效果。

 

 

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处,提供一种乳牙牙髓干细胞的长期体外培养和神经定向分化体系,其能更加简便、高效的获取高活性的原代乳牙牙髓干细胞,在神经定向分化过程中,缩短诱导周期、提高转化率。

为此,本发明提供了如下技术方案:

一种乳牙牙髓干细胞的分离提取、体外培养和神经定向分化的方法,其特征在于包括如下步骤:

步骤1、将牙齿进行消毒清洗;

步骤2、分离:破开牙冠,取出牙髓组织,用含有双抗的pbs溶液清洗牙髓组织;

步骤3、消化:将洗涤后的牙髓组织移入组织消化液中,用眼科手术剪将组织尽可能地剪碎;

步骤4、接种培养:将组织消化液1200rpm离心10min收集单个细胞和少量消化不完全的牙髓组织;小心弃去上清,将沉淀重悬,再次离心,彻底除去除消化酶,接种到12孔板,置于培养箱中进行培养;

步骤5、体外扩增培养:细胞培养用基础dmem培养液,添加的fbs和双抗,加入10ng/ml生长因子bfgf提高扩增效率;

步骤6、神经定向分化:诱导的第1-5天,在培养基中加入sb431542、dorsomorphin、cyclopamine此三种诱导剂;诱导的第6-11天,更换诱导剂为bfgf、egf、gdf9;诱导的第12-35天,更换诱导剂为bdnf、gdnf、klf-3、camp;随后去除诱导剂,继续培养2-3周。


乳牙牙髓干细胞分离方法

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